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DiD、DiO、DiI、DiR和DiS染料是一族亲脂性的荧光染料，可以用来染细胞膜和其它脂溶性生物结构。当与细胞膜结合后其荧光强度大大增强，这类染料有着很高的淬灭常数和激发态寿命。一旦对细胞染色，这类染料在整个细胞膜上扩散，最佳浓度时可以使整个细胞膜染色。它们的荧光颜色区分明显：DiI(橙色荧光)，DiO(绿色荧光)，DiD(红色荧光)和DiR (深红色荧光)这使得他们可以用来对活细胞进行多色成像和流式分析。DiO被广泛用于正向或逆向的，活的或固定的神经等细胞或组织的示踪剂或长期示踪剂(long-term tracer)。DiO通常不会明显影响细胞的生存力(viability)。

• DiO对于细胞膜染色的荧光强度通常要低于DiI，有时对于某些经过固定的组织的染色效果欠佳。
  
• 对于固定的细胞或组织，通常宜使用配制在PBS中的4%多聚甲醛进行固定，使用其它不适当的固定液会导致荧光背景较高。
  
• 荧光染料均存在淬灭问题，请尽量注意避光，以减缓荧光淬灭。
  
• 染色缓冲液经过过滤除菌处理，在使用时须注意避免微生物污染，否则很可能严重影响染色效果。如果染色缓冲液发生浑浊等明显的微生物污染，不能继续使用。
  
• 如果染色时间过长或染色后细胞继续培养，探针也可能进入细胞内而染色其它细胞器的膜。
  
• 本制品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。
  
• 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

• 细胞膜染色液制备
  工作液制备：用合适的缓冲液(如：无血清培养基，HBSS或PBS)稀释储存液，配制浓度为50～200μM的工作液。
  
  • 工作液的最终浓度是根据不同细胞和实验的经验来配制。可以从推荐浓度的两倍以上寻找最佳条件。
• 悬浮细胞染色
  
  • 加入适当体积的细胞膜染色工作液重悬细胞，使其密度为1～2×10⁶/mL左右。
    
  • 37℃避光孵育细胞5～20min，不同的细胞最佳孵育时间不同。以5min作为初始孵育时间，根据实际所用的细胞优化染色时间，以得到最佳的荧光染色效果。
    
  • 500～1000×g室温离心5min。
    
  • 吸除上清液，再次缓慢加入37℃预热的细胞培养液重悬细胞。
    
  • 重复c、d步骤两次。
    
  • 流式细胞仪检测，或将细胞转移至多孔板、细胞培养皿或者细胞爬片上，在荧光显微镜下观察。DiO的最大激发光波长为484nm，最大发射光波长为501nm。
• 贴壁细胞的染色
  
  • 将贴壁细胞种于细胞培养皿、多孔细胞培养板或者细胞爬片上，置于无菌实验室培养。
    
  • 吸除细胞培养液，用PBS洗涤细胞2遍。
    
  • 加入适当体积的细胞膜染色工作液，轻轻晃动使染料均匀覆盖所有细胞。
    
  • 37℃避光孵育细胞5～20min，不同的细胞最佳培养时间不同。以5min作为初始孵育时间，根据实际所用的细胞优化染色时间，以得到最佳的荧光染色效果。
    
  • 吸除细胞膜染色工作液，用PBS洗涤2～3次，然后加入37℃预热的细胞培养液即可在荧光显微镜下观察。DiO的最大激发光波长为484nm，最大发射光波长为501nm。
• 显微镜检测
  
  • DiD、DiO、DiI、DiR和DiS滤光器的选择参见表1。
    
  • 多色染料的同时检测，滤光器按照以下设定：
    ① DiI和DiO＝Omega XF52，Chroma 51004；
    ② DiI和DiD＝Omega XF92，Chroma 51007；
    ③ DiI，DiO和DiD＝Omega XF93，Chroma 61005
• 流式细胞仪的检测
  DiD、DiO、DiI、DiR染色的细胞可以分别用经典的FL1、FL2、FL3和FL4流式细胞仪检测。
  表1．细胞膜荧光染料对应波长与推荐滤光器：
  

  货号	产品名称	Ex/Em	推荐滤光器*
  KD1454	DiD Perchlorate	644/663nm	XF47-Omega,31023-Chroma
  KD1357	DiI perchlorate	549/565nm	XF32-Omega,31002-Chroma
  KD2109	DiO perchlorate	484/501nm	XF23-Omega,31001-Chroma
  KD1448	DiR iodide**	748/780nm	XF112-Omega,41009-Chroma

  • ^* Omega滤光器由Omega公司提供；Chroma滤光器由Chroma公司提供。
    
  • ^**DiR的发射波长肉眼不可见，所以需要配备CCD镜头或其他的近红外检测仪器